Выделение спор эндофита из почвы
Почву, содержащую тонкие корешки, замачивают в воде и раз­мешивают до разделения почвенных частиц, а затем процежи­вают через сито с отверстиями диаметром 500—600 мкм. Про­шедшую сквозь сито киселеобразную массу перемешивают, встряхивают и дают постоять, чтобы осели грубые минеральные частицы, после чего пропускают через другое сито, с диаметром отверстий 70—100 мкм. Осадок на сите изучают под микроско­пом. Такой способ отсеивания дает вполне хорошие результаты, поскольку покоящиеся споры эндофита диаметром 100—200 мкм превышают по размеру -крупнейшие среди грибов. Этот метод особенно хорош для легких песчаных почв, так как при избытке органики в почве обнаружить споры бывает сложно. Морфоло­гические признаки таких спор весьма своеобразны, и на них основана систематика этих грибов.
Другой метод заключается в выделении спор из обогати­тельной культуры, которую получают путем инокуляции опре­деленных сортов растений, выращиваемых в горшках, кусочка­ми корней с микоризой. В результате заражения в пересчете на горшок образуется гораздо больше спор (несколько тысяч), чем в полевых условиях (несколько сот на 100 г почвы), по­этому выделить их намного проще.
Получение одноразовых культур
Для получения одноразовой культуры на растениях определен­ного сорта для инокуляции корней проростков в стерильной почве берут 10—20 идентичных спор. В случае успешного зара­жения через 3—4 мес в горшке развивается гомогенная попу­ляция спор. Их можно выделить одним из описанных выше спо­собов и использовать для заражения новых партий опытных растений.
Крупномасштабное производство инокулятов
Технология, предложенная Менге и др. (Menge et al., 1977)\ представляет собой по сути дела модификацию только что опи­санного маломасштабного способа культивирования в горшках.
Корни растения с ВА-микоризой или же инфицированную почву используют для инокуляции растения-хозяина. При этом у рас­тения-донора и растения-хозяина, для которого предназначен вырабатываемый инокулят, не должно быть общих заболеваний корневой системы. Так, инокулят для цитрусовых можно полу­чать, размножая эндофит на суданской траве; использовать для этого цитрусовые не следует.
Споры, полученные при таком способе культивирования, можно подвегнуть поверхностной стерилизации и использовать для инокуляции других линий растений той же разновидности. Убедившись, что горшечные растения свободны от болезней и вредителей, которые могли бы поразить выбранные для иноку­ляции растения-хозяева, можно провести инокуляцию послед­них содержимым горшков. При получении инокулята рекомен­дуется использовать подходящие пестициды и фунгициды, не действующие на ВА-микоризу. Методы, подобные описанному, позволяют получать инокуляты в количестве, достаточном для промышленного выращивания растений с хорошо развитой ВА-микоризой в горшечной культуре. И все же метод горшечной культуры малоэффективен, и таким путем трудно получить ино­куляты в количестве, необходимом для полевых опытов. Не удивительно поэтому, что наряду с ним изучаются и другие методы. Кроме того, есть надежда, что исследование физиоло­гии эндофита позволит разработать метод его выращивания в чистой культуре, без растения-хозяина, в лабораториях. Это-существенно упростило бы производство инокулята, позволило,-бы получать более гомогенный, свободный от патогенов препа­рат. Сегодня же основой для производства инокулята остаются несущие микоризу растения.
Получение чистых инфицированных корней
В настоящее время изучается возможность получения чистых корней, инфицированных эндофитом ВА. Опубликованы результаты пер­вых опытов, в которых при производстве инокулята использо­вали фасоль (Phaseolus vulgaris) и кукурузу (Zea mays). Спо­ры или корешки с микоризой, завернутые в небольшие кусочки гигроскопичного материала, помещали между корнями, где цир­кулировал питательный раствор, и получали гораздо более чи­стые инфицированные корни, чем при выращивании в почве, но эндофит распространялся в корневой массе медленно. Когда такие корни с микоризой применяли для инокуляции в опытах с проростками салата, лука, фасоли и кукурузы, наблюдалось нормальное образование ВА-микориз. При инфицировании про­ростков фасоли и салата культурами трех разных видов эндофитов рода Glomus, полученными с помощью метода питатель­ной пленки, во всех случаях образовывались видоспецифичные микоризы. Каждый препарат данного инокулята был не менее эффективен, чем препарат такой же массы, полученный методом горшечной культуры. При высушивании на воздухе инфекцион-лость уменьшалась, но инактивации препарата не происходило (Elmes, Mosse, 1980).
Метод питательной пленки хорош тем, что можно строго контролировать условия роста и видоизменять их так, чтобы микориза развивалась успешно, без помех со стороны коллои­дов почвы. Так, опыты, о которых речь шла выше, показали, что для хорошего развития проростков кукурузы и микоризы необходимо присутствие 5,6 мг/л железа в форме NaFe-ЭДТА; при концентрации азота в циркулирующем растворе 11 мг/л (95% в форме NO3- и 5% в виде NH4+) наблюдалось подав­ление заражения эндофитом, но если концентрация азота в рас­творе была 1 мг/л, то заражение протекало нормально. Таким образом, этот метод весьма перспективен как для изучения ми­коризных заражений, так и при крупномасштабном производ­стве инокулятов для полевых опытов и на продажу.