Криобиологические сосуды > Сельское хозяйство и биотехнология > Современные инокуляты на твердых носителях

Современные инокуляты на твердых носителях


Rhizobium, выращенные на агаре или в жидкой среде, после высушивания на поверхности семян быстро погибают, да и са­ми культуры их нежизнестойки. Этих недостатков лишены ино­куляты на торфяной основе, которые были созданы в США, а сегодня применяются повсеместно.
При получении культуру нужного штамма Rhizobium выра­щивают обычным способом в ферментере объемом в несколько литров в жидкой среде (например, содержащей маннитол и дрожжевой экстракт). Установка может быть очень несложной, лишь бы ее устройство обеспечивало защиту от микробного загрязнения. Температуру среды поддерживают в интервале 25—28 °С, и осуществляют интенсивную аэрацию, продувая че­рез среду стерильный воздух. Контроль за рН осуществлять не нужно, особенно если в среду добавлено немного СаСОз. К мо­менту смешивания с торфом (носителем) —стерильным или не­стерильным— плотность культуры должна быть достаточно вы­сокой, 5-Ю8—4-Ю9 клетка/мл. В случае медленно растущих штаммов (например, R. lupini) со средним временем удвоения числа клеток около 10 ч обычно бывает сложно получить куль­туру с высокой плотностью, и нередко даже размножение более быстро растущих штаммов (со средним временем удвоения 3 ч) подавляется видами-загрязнителями. Для обеспечения быст­рого роста культуры на жидкой среде полезно вносить сразу много бактерий.
Культуры на торфяном носителе
Торф высушивают либо при обычной температуре, либо при осторожном нагревании до влажности около 10% (на сухую массу), а затем измельчают при помощи молотковой мельницы до порошка, который просеивают через сито (200 меш) и дово­дят рН до 6,5—7,0, добавляя тонко измельченный СаСО3. Такой торф можно использовать как стерильный или нестерильный носитель. О пригодности партии торфа для получения инокуля-тов Rhizobium нельзя судить по общим его свойствам, и на каж­дой из них проводят пробные выращивания именно тех штам­мов, которые предполагается использовать. Рост и выживае­мость бактерий в торфе зависят от многих факторов.
Нестерильные инокуляты на торфе
К подготовленному измельченному торфу добавляют до 40% (по массе) жидкой культуры, тщательно перемешивают смесь и оставляют ее для созревания в неглубоких лотках. Через не­сколько суток смесь опять перемешивают, а затем фасуют, обычно в заплавленные мешочки из полиэтиленовой пленки (толщиной 0,0375 мм). За первые несколько недель после при­готовления смеси число жизнеспособных клеток Rhizobium обычно увеличивается в 2—5 раз. Если держать фасовки при низкой температуре, бактерии обычно долгое время сохраняют жизнеспособность. Возможное время хранения оценивают ис­ходя из продолжительности периода, за который погибает 90% клеток (время уменьшения численности до 1/10 от первоначаль­ной). Это время варьирует от 90 недель (при 5°С) до 8 (при 25 °С). При благоприятных условиях культуры можно хранить до года (время уменьшения численности до 1/10 >16 недель), но срок этот заметно меньше, когда они содержатся при ком­натной температуре. Точно предсказать возможную продолжи­тельность хранения нельзя, и ее приходится определять для каждой партии отдельно.
Стерильные инокуляты на торфе
Заплавленные полиэтиленовые или полиамидные мешочки с под­готовленным измельченным влажным торфом стерилизуют в ав­токлавах (например, при 115°С в течение 4 ч) или же путем у-облучения (примерно 4,5-Ю6 рад). Затем при помощи шпри­ца для инъекций в них вводят нужный объем жидкой культуры (порядка 10 мл). Прокол запаивают и мешочки ставят на ин­кубацию, в ходе которой происходит существенное размножение бактерий.
Носители для Rhizobium
Твердый инокулят состоит из бактерий и носителя, роль кото­рого заключается в поддержании жизнеспособности клеток, по­скольку он частично защищает их от пересыхания. Кроме того, носитель способствует более равномерному распределению бак­терий в массе семян и помогает им прикрепиться к их поверх­ности. Хотя в случае бактериальных суспензий нередко получа­лись хорошие результаты, считается, что применение торфа как носителя более эффективно: при использовании жидких культур или же суспензий' клетки Rhizobium после инокуляции и при­креплении их к поверхности семян оказываются практически беззащитными. Поэтому при производстве коммерческих ино-кулятов вначале чаще всего использовали именно торф. Однако торф есть далеко не везде, а если он и имеется, то сказать заранее, пригоден ли он как носитель, невозможно. В связи с этим были предприняты поиски альтернативных носителей с такими же защитными свойствами, как у торфа.
С неодинаковым успехом для этой цели были испробованы всевозможные композиции: разнообразные смеси почвы и торфа,, в которые были добавлены молотая люцерна, измельченная со­лома, дрожжи или сахар; нильский ил с добавками питательных веществ; почва, смешанная с кокосовыми охлопьями или дре­весным углем. Опробованы также вермикулит, перегнившие опилки, бентонит, кизельгур и каменный уголь. В Африке удач­ный носитель был получен путем компостирования кукурузных кочерыжек в течение 30 недель вместе с молотым известняком, суперфосфатом и азотнокислым аммонием. Полученный ком­пост высушивали на воздухе, измельчали, просеивали, разве­шивали по 100 г в плотные полиэтиленовые мешочки и авто-клавировали.
Сегодня для поддержания жизнеспособности Rhizobium по­лучают носители из самых разнообразных веществ, но лучшим носителем все же является торф. В некоторых регионах, напри­мер в развивающихся странах, определенную ценность могут представлять дешевые местные заменители торфа.