Криобиологические сосуды > Сельское хозяйство и биотехнология > Регенерация растений из протопластов

Регенерация растений из протопластов


Шеферд и Тоттен (Shephard, Totten, 1977 г.) в опытах с кар­тофелем, у которого регенерация растений из культуры тканей затруднена, разработали метод, позволяющий достаточно успеш­но регенерировать растения из протопластов. Их способ был несколько необычным, поскольку предусматривал особые усло­вия выращивания растений, из которых потом получали прото­пласты. Кроме того, на каждой стадии развития растений-реге-нерантов они применяли особую среду.
Выращивание растений для опытов
Растения картофеля (американский сорт Russet Burbank) вы­ращивали из клубней, свободных от Х-вируса, при высокой освещенности (продолжительность светового дня 12 ч), при 24°С и относительной влажности 70—75%. Перед началом опыта рас­тения выдерживали 4—10 сут при той же температуре и влаж­ности, но более слабом (7000 люкс) и менее продолжительном освещении (6 ч в сутки). Содержание растений в условиях сла­бого и непродолжительного освещения приводило к существен­ному увеличению выхода жизнеспособных протопластов из тка­ней листьев (до 2—3-106 на 1 г ткани).
Среды для выделения и размножения
При выделении и размножении протопластов применяли среды пяти типов (А—-Е), которые представляли собой варианты среды, предложенной Лэмом (Lam, 1975). В их состав входили основные питательные вещества растений, микроэлементы, аминокислоты, факторы роста, фитогормоны и регуляторы осмоти­ческого давления. Содержание веществ подбиралось так, чтобы обеспечить оптимальный рост на каждом этапе регенерации. Все среды содержали 1,5—2,0% агара, кроме полужидкой сре­ды А, где его концентрация составляла только 0,5%. Среды D и Е, использованные на заключительном этапе, содержали 1650 мг/л NH4NO3.
Выделение протопластов
4 г ткани, вырезанной из стерилизованных с поверхности моло­дых листьев, инкубировали в 200 мл среды А (без сахарозы и агара) в темноте при 4°С в течение 16—24 ч. Затем среду за­меняли на 100 мл забуференного (рН 5,6) раствора с фермен­тами, чтобы отделить мезофильные клетки и удалить их клеточ­ные оболочки. При встряхивании смеси процесс заканчивался за 4 ч при 28 °С. Жизнеспособные протопласты после процежи­вания смеси собирали центрифугированием, промывали сре­дой А, снова осаждали и хранили в жидкой среде А при кон­центрации 6-105 клетка/мл.
Рост каллуса
При инкубации протопластов на твердой среде В или на моди­фицированной твердой среде происходит регенерация клеточных стенок и ограниченное деление клеток, в результате чего обра­зуются микрокаллусы. После переноса в среду С они растут далее до стадии, когда становится возможным перенос в сре­ду D, где индуцируется образование (морфогенез) побегов. На заключительной стадии каллусы с побегами длиной около 1 мм переносят на среду Е для завершения образования побегов и формирования корней. Укорененные растения пересаживают в небольшие горшочки с вермикулитом, где они и растут далее.
Здесь изложена суть метода, который следует использовать для регенерации целых растений из одиночных протопластов, и проиллюстрировано, как экспериментатору приходится варь­ировать условия на разных стадиях развития, чтобы добиться успеха. На рис. 9.7—9.10 показано, как выглядят свежевыде­ленные протопласты, молодые каллусы и крошечные растения, регенерированные из ткани каллуса. Особенно важно в этой работе строго выдерживать надлежащие условия, однако почти наверняка их придется специально подбирать для каждого изу­чаемого вида растений.
Томасу (Thomas, 1981) удалось получить культуры побегов тетраплоидного картофеля сорта Maris Bard, которые использо­вались как исходный материал для выделения протопластов.
 Свежевыделенные протопласты Solanum brevidens

Рис. 9.7. Свежевыделенные протопласты Solanum brevidens.
Каллусы, образовавшиеся из протопластов
 
Рис 9.8. Каллусы, образовавшиеся из протопластов Solarium brevidens на ага­ре. Снимок сделан примерно через месяц после получения протопластов Для выращивания использована чашка Петри диаметром 9 см.
Регенерация мини-растений Solarium tuberosum
 
Рис. 9.9. Регенерация мини-растений Solarium tuberosum из каллусной ткани, полученной из протопластов (снимок сделан примерно через 100 сух после пе­ренесения на агаровую среду, способствующую регенерации).
Регенерация мини-растений Solarium brevldens
 
Рис. 9.10. Регенерация мини-растений Solarium brevldens из каллусной ткани, полученной из протопластов (снимок сделан приблизительно через 100 сух после перенесения на агаровую среду, способствующую регенерации).

Пазушные почки стерилизовали с поверхности раствором гипо-хлорида натрия и культивировали затем на среде Мурасиге и Скуга (Murashige, Skoog, 1962), содержащей, кроме того, сахарозу (30 г/л), агар (6 г/л) и 6-бензиламинопурин (6-БАП, 0,5 мг/л), рН 5,8. В ходе инкубации при 26 °С при освещенности ~400 люкс (16 ч днем, 8 ч ночью) за 3—5 нед образовывались ростки длиной около 3 см. Их можно было использовать для дальнейшего размножения на той же среде, но без 6-БАП, для чего брали короткие (3—8 мм) отрезки стебля с листом и па­зушной почкой. Рост продолжался три недели, после чего по­беги можно было опять использовать для размножения или же выделения протопластов. Цельные проростки (но не взятые от­дельно листья) давали жизнеспособные протопласты, которые могли длительное время делиться в культуре.