Криобиологические сосуды > Сельское хозяйство и биотехнология > Методы слияния протопластов

Методы слияния протопластов


Хотя о возможности слияния протопластов растений было из­вестно уже давно, метод контролируемого слияния с воспроиз­водимыми результатами был разработан лишь в 1970 г. (Power et al., 1970). Тем самым был сделан первый шаг к соматической гибридизации растений. При суспендировании протопластов в 0,25 М растворе азотнокислого натрия слияние происходило очень быстро. Впоследствии для индукции слияния протопластов Parthenocissus tricuspidata и Petunia hybrida использовали 10,2%-ный раствор сахарозы, содержащий 5,5% азотнокислого натрия. Для той же цели применяли хлористый кальций.
Было показано (Као, Michayluk, 1974), что полиэтиленгли-коль с большой молекулярной массой также вызывает неспе­цифическое слипание, а затем и слияние протопластов растений. При инкубации в самом полиэтиленгликоле слияний почти не происходило, но при его разведении гибриды образовывали до 10% протопластов. ПЭГ способствовал также захвату хлоро-пластов водоросли Vaucheria dichotoma протопластами морко­ви. Методы слияния протопластов подробно описаны в руковод­стве Пауэра и Дэйви (Power, Davey, 1979).
Получение соматических гибридов
Для осуществления гибридизации соматических клеток методом слияния протопластов необходимо выполнить следующие опе­рации:
1) выделить протопласты;
2) осуществить слияние-
3) регенерировать клеточные стенки;
4) осуществить слияние ядер так, чтобы получить полноценное гибридное ядро- 5) раз­множить гибридные клетки;
6) регенерировать целое растение
Осуществить, слияние протопластов растений, вообще говоря, несложно, но из этого не следует, что столь же просто раз­множить гибридные клетки или же регенерировать гибридное растение. Прежде всего нужно отобрать гибридные протопла­сты, которые составляют лишь малую часть всех клеток, а за­тем создать им условия для развития. Примером работы такого рода может быть эксперимент по соматической гибридизации Petunia hybrida и Petunia parodii. Здесь отбор был основан на различиях в способности к росту протопластов из листьев этих двух видов растений. Дело в том, что протопласты Petunia pa­rodii в использованной в этом опыте среде могли формировать лишь микрокаллусы, состоящие не более чем из пятидесяти клеток, в то время как из протопластов Petunia hybrida можно получать растущие каллусы. Было использовано также и то обстоятельство, что протопласты Petunia hybrida более чувстви­тельны к актиномицину D, чем протопласты Petunia parodii.
Гетерокарион, образующийся в результате слияния двух раз­ных протопластов, может после слияния ядер превратиться в гибридную клетку. Имеется в виду, что происходит объединение всех несущих гены, самореплицирующихся органелл обоих протопластов, в то время как при обычном половом скрещивании от каждой родительской клетки поступает по ядру, несущему хромосомные гены (кариомы), но гены, передаваемые с пласти­дами (пластидомы) и митохондриями (хондриомы), передаются обычно лишь от женской клетки. Таким образом, методы на основе слияния протопластов позволяют получать комбинации двух полных родительских геномов. Слияние протопластов двух скрещивающихся половым путем видов нередко приводит к об­разованию стабильных амфиплоидных гибридных клеток, из ко­торых могут быть регенерированы растения — соматические гиб­риды. Надо сказать, что метод слияния протопластов пригоден для работы не только со столь близкими видами или гибридны­ми клетками.
Томас и др. (Thomas et al., 1979) перечисляет ряд работ, в которых была осуществлена регенерация в экспериментах по слиянию протопластов растений, принадлежащих к одному и тому же (7 случаев) и разным (14 случаев) видам. В четырех экспериментах по межвидовому слиянию были получены линии клеток, а в четырех других — осуществлен захват клеточных органелл протопластами. В двух опытах в протопласты растений была введена чужеродная ДНК, которая экспрессировалась, а в трех из протоклонов были получены мутантные растения. Способы применения метода слияния протопластов весьма мно­гообразны.
Возможность образования соматических гибридов создает предпосылки для изменений внеядерного генного компонента гибридных клеток. Для этого, например, можно использовать протопласты-альбиносы, в которых нет хлоропластных генов, или же протопласты, у которых во время слияния проводится инактивация ядерного генома одного из родителей. Донорами цитоплазматических генов, вводимых путем слияния в полно­ценные протопласты, могут быть безъядерные субпротопласты или микропласты.
Захват протопластами микроорганизмов и ДНК
Дэйви и Пауэр (Davey, Power, 1975) обнаружили, что ПЭГ способствует захвату клеток и протопластов дрожжей и клеток сине-зеленых водорослей протопластами Parthenocissus tricuspi-data. При этом микроорганизмы локализуются в ограниченных мембранами пузырьках (везикулах) цитоплазмы протопластов. Значительный интерес представляет возможность введения в протопласты интактных микроорганизмов с полезными свойст­вами, например таких, которые способны фиксировать азот. Другой вариант — это введение в высшие растения генетическо­го материала микробов с последующей его экспрессией. В прин­ципе методы слияния протопластов вполне могут использовать­ся для этой цели, но пока успехи и в этой области весьма скром­ны (Thomas et al., 1979).
При введении в протопласты нового генетического материа­ла в виде чистой ДНК последняя не всегда сохраняется и экс-прессируется в хозяйских клетках. Весьма перспективным пред­ставляется использование в качестве векторов Ti-плазмид Agro-bacterium tumefaciens, так как они непосредст­венно включаются в ДНК хозяина и легко экспрессируются при образовании опухолей. Ti-плазмиды, содержащие или не содер­жащие чужеродной ДНК, могут вызвать трансформацию про­топластов растений. По-видимому, такие исследования будут проводиться все более интенсивно.