Криобиологические сосуды > Химия и биотехнология > Ауксотрофные мутанты

Ауксотрофные мутанты


Ауксотрофные мутанты не могут образовывать ингибиторы соответствующего метаболического пути, работающие по прин­ципу отрицательной обратной связи, так как у них отсутствует определенная ключевая ферментативная реакция. Поэтому при выращивании мутантного штамма в среде с минимальной кон­центрацией необходимого питательного ингредиента они способ­ны образовывать избыточные количества вещества-предшест­венника или близких к нему метаболитов блокированной реак­ции. Так, первые реакции в цепи биосинтеза L-аргинина (рис. 4.5) у Corynebacterium glutamicum ингибируются по ме­ханизму обратной связи самим конечным продуктом, и образо­вание соответствующих ферментов подавляется L-аргинином. У цитруллинового ауксотрофа этой бактерии отсутствует фер­мент, называемый орнитин-карбамоилтрансферазой, который катализирует превращение орнитина в цитруллин на одном из промежуточных этапов биосинтеза L-аргинина. Синтез аргинина не идет, что приводит к снятию ингибирования по принципу обратной связи со всех ферментов этого пути и накоплению избытка орнитина. Ауксотрофиые мутанты находят применение и в тех случаях, когда необходимо синтезировать соединения, являющиеся конечными продуктами разветвленных цепей мета­болических реакций. Так, L-аспартат является общим предшест­венником для L-лизина, L-треонина, L-метионина и L-изолей-цина. Первая реакция в процессе образования зсех этих амино­кислот катализируется аспартокиназой, активность которой может быть ингибирована по механизму обратной связи при совместном действии L-лизина и L-треонина. У мутантов, аук-сотрофных по гомосерину или треонину/метионину, существен­но снижается внутриклеточная концентрация L-треонина, что снимает блокаду с аспартокиназы и позволяет клеткам накап­ливать L-лизин.
Биосинтез L-аргинина
 
Рис. 4.5. Биосинтез L-аргинина.
 
Получить ауксотрофные мутанты, способные накапливать конечные продукты неразветвленных цепей биосинтеза, напри­мер L-аргинин, невозможно. В таких случаях приходится отби­рать мутанты с частично нарушенной регуляцией биосинтеза, что позволяет получить повышенный выход конечного продукта. Такие мутанты известны под названием регуляторных; их отби­рают по устойчивости к аналогам аминокислот или же среди ревертантов ауксотрофов. В основе использования аналогов аминокислот лежит их сходство с природными аминокислотами. Они ингибируют рост бактерий, но этот эффект может быть уменьшен путем добавления соответствующей природной ами­нокислоты. Таким образом, аналоги выступают в роли искусст­венных, работающих по принципу обратной связи, ингибиторов ферментов, обеспечивающих биосинтез природных аминокислот, и одновременно подавляют процесс их включения в белки. Появление мутантов, устойчивых к этим ложным ингибиторам, означает, что регуляторные ферменты соответствующего пути обмена становятся у них нечувствительными к аналогу. Так, серусодержащий аналог лизина 5-(2-аминоэтил)-Ь-цистеин яв­ляется у Brevibacterium flavutn ложным, действующим по прин­ципу обратной связи ингибитором аспартокиназы. Устойчивые к его действию мутанты вырабатывают фермент, который в 150 раз менее чувствителен к ингибированию по механизму обрат­ной связи, чем фермент исходного штамма, и в результате про­дуцируют до 33 г/л лизина. Для увеличения выхода можно воспользоваться как ауксотрофией, так и дефектами регуляции одновременно. Так, у Corynebacterium glutamicum и Brevibac­terium flavutn сверхпродукции L-треонина не наблюдается, по­скольку происходит сочетанное ингибирование по механизму обратной связи аспартокиназы и L-треонином, и L-лизином, а L-треонин ингибирует и гомосериндегидрогеназу. Мутант, ус­тойчивый к аналогу треонина, а-амино-р-оксивалериановой кис­лоте, синтезирует в избыточном количестве треонин, так как ферменты его, ингибированные этой аминокислотой, десенсиби­лизированы. Принимающие участие в синтезе треонина гомо-сериндегидрогеназа и киназа также «выключаются» L-метиони-ном, и поэтому ауксотрофы по метионину образуют L-треонин с еще большим выходом.
Регуляторные мутанты можно получить путем трансдукции,, проводя при этом отбор отдельных мутаций, вызывающих пол­ное рассогласование регуляторных механизмов, а затем объединяя эти признаки путем ко-трансдукции. Таким способом У одного штамма последовательно может быть закреплена устойчи­вость к нескольким аналогам.