Криобиологические сосуды > Химия и биотехнология > Повторное использование кофактора

Повторное использование кофактора


Для проявления каталитической активности 30% известных фер­ментов нужен один из пяти кофакторов (NAD, NADP, ATP, FAD либо СоА). Само применение этих ферментов в биоката­лизе будет определяться тем, удастся ли повторно использовать эти дорогие вещества либо вообще обойтись без них. Существу­ет три подхода к решению этой проблемы: ферментативный, химический и электрохимический.
Ферментативную регенерацию кофакторов, например, можно осуществить при участии ряда имеющихся в продаже фермен­тов, которые в качестве восстановителя используют дешевые субстраты. В этом направлении была проведена большая работа по использованию формиатдегидрогеназы — фермента, который катализирует восстановление NADH при превращении формиа-та в углекислый газ. Так как продукт реакции является газом, он легко удаляется из реакционной смеси и не мешает выделе­нию из нее продукта реакции. Основная трудность здесь — по­теря самого кофактора из реакционной смеси. Предпринимались попытки повторного использования регенерированного кофакто­ра в такой системе путем присоединения его к более крупным молекулам с сохранением его каталитической активности. Такой .комплекс можно удерживать в реакторе при помощи ультра-рильтрующей или гидрофобной жидкой мембраны. NAD вклю­чали в полиэтиленгликоль (с мол. массой 10000—40000) и ис­пользовали в мембранном реакторе. К сожалению, каталитиче­ская активность таких иммобилизованных кофакторов обычно сильно падает и составляет всего несколько процентов от их активности в свободной форме. Коферменты и соответствующие регенерирующие ферменты стабилизировали также путем им­мобилизации в структуре гелей.
Химическое окисление NADH можно осуществить в реакции присоединения к нему кислорода с использованием акцепторов электронов вроде PMS/DCPIP или FMN.
Несомненный интерес представляет и электрохимическое окисление NAD(P)H и восстановление NAD(P)+. Для окисле­ния восстановленных коферментов был предложен ряд электро­дов. Осуществить стереоспецифическое электрохимическое вос­становление оказалось гораздо сложнее. Недавно были разра­ботаны соответствующие процессы с применением электродов с ферментами, которые участвуют в реакции стереоспецифиче-ского восстановления за счет электрохимического восстановле­ния редокс-центров ферментов. Это удалось осуществить бла­годаря разработке методов переноса электронов между элект­родами и этими редокс-центрами. В результате в некоторых случаях каталитический процесс протекает в отсутствие кофак­тора. Такое замещение кофактора модифицированным электро­дом, видимо, легче осуществить для реакций восстановления, чем окисления.