Криобиологические сосуды > Генетика и биотехнология > Гибридизация путем скрещивания

Гибридизация путем скрещивания


Наиболее простой путь создания организмов с желаемым комп­лексом генетически обусловленных признаков — это скрещива­ние штаммов, принадлежащих к противоположным половым типам. Как про так и эукариотические микроорганизмы скре­щиваются при контакте клеток, и этот процесс используется для получения рекомбинантов.
Конъюгация у бактерий
У бактерий половой процесс называют конъюгацией. Контакт между двумя клетками осуществляется за счет образования длинного конъюгационного мостика, который служит для пере­носа ДНК из одной клетки в другую. Способность к формиро­ванию мостика закодирована во многих плазмидах по нему они переносят свои гены, а в некоторых случаях и гены клетки-хозяина в клетку-реципиент. Плазмиды, осуществляю­щие перенос генов клетки-хозяина, обладают, таким образом, способностью к мобилизации хромосом. У Escherichia coli та­кие F-плазмиды выступают в роли фактора пола. Они способ­ны мобилизовать хромосому не только Е. coli, но и родствен­ных энтеробактерий (Shigella, Klebsiella, Salmonella, Erwinia) и поэтому могут использоваться для переноса генов между бактериями разных родов. Некоторые плазмиды, выделенные из Pseudomonas aeruginosa, еще более «неразборчивы». Так, плазмида R68.45 может переносить хромосомные гены между видами Pseudomonas, в том числе и Pseudomonas putida, но кроме этого, обладает способностью к мобилизации хромосом и таких родов, как Rhizobium, Rhodopseudomonas, Azospirillum, Agrobacterium и Escherichia.
К числу наиболее широко используемых в промышленности микроорганизмов Относятся разнообразные виды Streptomyces с их помощью получают более 60% разновидностей при­меняющихся сегодня антибиотиков. У этих организмов хорошо развиты системы скрещивания, которые обнаружены и у их близких родственников, видов Nocardia (они синтезируют ан­тибиотики рифамицины). Способность к конъюгации была от­крыта при изучении Streptomyces coelicolor (этот вид примене­ния в промышленности не нашел и используется в лабораториях). В клетках этого организма было найдено два типа плазмид, SCP1 и SCP2, несущих фактор пола. SCP2 продуцирует ре-комбинантные формы с очень высокой частотой. SCP1 по сво­им свойствам близка к F-плазмиде Е. coli. Она может встраи­ваться в хромосому Streptomyces, а также включать фрагмен­ты хромосомной ДНК. Это довольно крупная плазмида (Mr = 18-106), несущая все шестнадцать генов, нужных для обра­зования антибиотика метиленомицина.
Многие используемые в промышленности виды Streptomyces, видимо, не обладают собственной системой скрещивания, яо у Streptomyces rimosus, продуцента окситетрациклина, най­дена плазмида SRP1, которая несет активный фактор пола, и при скрещивании SRP1+XSRP1- рекомбинантные формы обра­зуются с частотой 10-4—10-3.
У других грамотрицательных бактерий (помимо Streptomy­ces) конъюгационные плазмиды встречаются относительно ред­ко. Отметим, что недавно система скрещивания была обнару­жена у бактерий такого важного в промышленном отношении рода, как Bacillus. Существенно, что эти бактерии способны легко акцептировать «голую» ДНК, и поэтому рекомбинант­ные формы несложно получить путем трансформации. Такая .возможность была использована при создании штаммов Bacil­lus, у которых около 50% синтезируемого ими белка составля­ет гидролизующий крахмал фермент а-амилаза. При этом бы­ли отобраны несколько мутантов по разным генам с повышен­ной способностью к образованию фермента. Эти разные мута­ции были затем сведены воедино у одного штамма путем по­следовательной трансформации хромосомной ДНК и отбора на повышенную способность гидролизовать крахмал.