Криобиологические сосуды > Генетика и биотехнология > Включение ДНК в плазмидные и фаговые векторы

Включение ДНК в плазмидные и фаговые векторы


Обычно выбор вектора определяется штаммом хозяина, кото­рый используется для экспрессии клонированной ДНК. Если в роли хозяина выступает Е. coli, плазмидный вектор скорее всего представляет собой произ­водное pBR322, а если хозяи­ном является Bacillus spp., то векторные плазмиды получают из различных видов Bacillus или Staphylococcus. Вектор для Saccharomyces cerevisiae кон­струируют либо на основе плазмиды длиной 2 мкм, либо из фрагментов хромосомы дрожжей, способных реплици­роваться подобно плазмидам. Нередко используются чел­ночные векторы, которые мо­гут реплицироваться в одном или нескольких организмах хозяевах. Применение таких векторов оказывается весьма перспективным в связи с тем, что нередко для наработки большого количества плазмид и для трансформации ДНК удобнее в роли хозяина использовать Е. coli. Строение плазмиды pBR322 показано на рис. 7.3. Она несет гены устойчивости к тетрациклину и ампициллину. На карте указаны места расщепления этой молекулы эндонуклеазами рестрикции (рестриктазами).
Нуклеотидные последователь­ности
 
Рис. 7.6. Нуклеотидные последователь­ности, узнаваемые и расщепляемые эндонуклеазами рестрикции AluI (вверху) и BamHI (внизу).
 
Используемые при клонировании рестриктазы выделяют из различных прокариот. Всего было получено более ста пятидеся­ти их разновидностей. Они отличаются друг от друга тем, что узнают и расщепляют разные нуклеотидные последовательно­сти. Сайты узнавания для большинства ферментов, используе­мых в генетической инженерии, представляют собой палиндро­мы из 4, 5 или 6 нуклеотидов. Расщепление происходит с обра­зованием либо «тупых» (как в случае AluI ), либо липких (спо­собных к комплементарному связыванию) концов (как в случае BamHI см. рис. 7.6). Неспаренные нуклеотиды липкого конца) оканчиваются 3'-гидроксильной или 5'-монофосфатной группи­ровкой в зависимости от фермента.
Обычный метод клонирования ДНК основан на расщепле­нии плазмидной и встраиваемой ДНК одной и той же рестрик-тазой. При этом получаются молекулы с липкими концами, ко­торые затем отжигают, получают кольцевую рекомбинантную молекулу и сшивают ДНК-лигазой фага Т4. В случае плазми­ды pBR322 встраивание обычно осуществляют по генам устой­чивости к антибиотикам, поскольку такие рекомбинантные мо­лекулы легко распознать по их неспособности обеспечить устойчивость.
ДНК-лигазу фага Т4 можно применять и для сшивания «тупых» концов молекул ДНК, хотя этот процесс осуществляется труднее, чем в случае липких концов. Липкие концы можно превратить в тупые путем отщепления одноцепочечных высту­пающих участков специфичными только к таким участкам нуклеазами. Альтернативный способ основан на использовании ДНК-полимеразЫ: она присоединяет к короткой Цепи недо­стающие нуклеотиды, комплементарные 5'-одноцепочечной вы­ступающей части молекулы. Лигаза применяется также для встраивания в плазмиды синтезированных фрагментов ДНК с целью получения на стыке ДНК-вставки и вектора нужной по­следовательности. Комплементарные одноцепочечные концы у вектора и встраиваемой ДНК могут быть образованы при помоЩи концевой ДНК—нуклеотидилтрансферазы: она присоеди­няет нуклеотиды к 3'-концам молекуй ДНК. С её помощью к 3'-концам вектора могут быть добавлены «хвосты» из несколь­ких остатков дезоксигуаниловой кислоты [oligo(dG)], а к концам встраиваемой молекулы — комплементарная последова­тельность oligo(dC). Смысл этой процедуры состоит в том, что повторное лигирование вектора становится невозможным.