Криобиологические сосуды > Генетика и биотехнология > Трансформация

Трансформация


Полученные in vitro рекомбинантные плазмиды необходимо пе­ренести в подходящую клетку-хозяина, природа которой и оп­ределяет особенности способа трансформации. Так, клетки Е. coli становятся компетентными, (т. е- способными захваты­вать очищенную ДНК) после обработки их на холоду СаСl2, а клетки Bacillus subtilis приобретают компетентность на опре­деленной фазе клеточного цикла при их разовом культивирова­нии в условиях дефицита питательных веществ. Многие дру­гие бактерии, включая виды Streptomyces, можно трансформи­ровать только в форме протопластов, когда удалены клеточные стенки. Для облегчения проникновения ДНК в дрожжевые клетки после обработки их СаСl2 или ПЭГ из этих клеток так­же часто получают протопласты. Интактные, дрожжевые клет­ки становятся компетентными после обработки ионами щелоч­ных металлов, например Li+.
 
Экспрессия клонированных генов
 
Цель многих опытов по клонированию состоит в наработке в большом количестве какого-либо белка эукариот. Именно для этого:и встраивают гены эукариот в плазмиды бактерий. Что­бы достичь высокого уровня экспрессии гена, эукариотическую ДНК нужно встроить вблизи от активного промотора транскрипции; образующаяся мРНК при этом должна эффективно транслироваться. Промоторы, использующиеся для обеспечения активной экспрессии, обычно не принадлежат к числу изна­чально присутствующих в плазмйдах. Как правило, это бывают промоторы фаговых или хромосомных генов, включаемые в ялазмидные векторы. Типичным примером такого рода служит промотор PL бактериофага γ. ДНК с таким промотором эффек­тивно транскрибируется, и образуется большое количество-мРНК. Контроль за работой PL осуществляется белком-репрессором, продуктом гена C1 этого бактериофага. Ген C1857 кодиру­ет температурочувствительный белок-репрессор, который акти­вен при 30°С, но не работает при 42°С. Если внести этот ген в составе плазмиды или фага в ту же клетку, что и промотор- PL, то экспрессию клонированных генов, контролируемую  PL, можно регулировать, изменяя температуру.
У дрожжей Saccharomyces cerevisiae векторы с высоким уровнем экспрессии конструируют на основе промоторов генов, которые кодируют важнейшие клеточные белки (например, ал-когольдегидрогеназу и фосфоглицераткиназу). Так, с помощью-промотора алкогольдегидрогеназы С1 удалось добиться прямой транскрипции в дрожжах гена инсулина человека, а в опытах с использованием промотора фосфоглицераткиназы получен высокий уровень экспрессии генов интерферонов.
С помощью бактерий были получены с высоким выходом не­которые белки — продУкты генов животных и их вирусов. Так, были созданы штаммы Е. coli, у которых 20% всего клеточно­го белка составляли коровый антиген вируса гепатита В, гор­мон роста человека или главный капсидный антиген вируса ящура. У одного из сконструированных штаммов В. sub tills последний составлял около 1 % синтезируемого этой бактерией белка. Однако добиться экспрессии в бактериальных клетках генов некоторых белков животных или их вирусов совсем не­просто, даже если эти гены сопряжены с сигналами инициации транскрипции и трансляции, которые обеспечивают в норме высокий уровень экспрессии генов прокариот. Причины такой неэффективной экспрессии не всегда ясны, но в некоторых слу­чаях удалось установить, что протеазы бактерий быстро разру­шают белки животных и вирусов. В подобных ситуациях мож­но повысить выход, применяя несодержащие протеаз мутанты. При выработке проинсулина, предшественника инсулина, неко­торая защита от протеаз обеспечивается тем, что полипептид, секрётируется в периплазматичёское пространство у клеточной стенки Е. coli. На N-конце молекулы препроинсулина нахо­дится последовательность гидрофобных аминокислот, с по­мощью которой (с одновременным ,ее отщеплением) осуществ­ляется транспорт этой молекулы через мембрану в периплаз-
матическое пространство. Время   полужизни   проинсулина в клетке 2 мин, а в периплазматическом пространстве 20 мин.
Другой способ получения чувствительных к протеазам бел­ков основан на выделении их бактериями Bacillus в окружаю­щую среду. Эти бациллы в отличие от Е. coli способны экскре-тировать некоторые белки. Так, получены штаммы Bacillus, осуществляющие экскрецию проинсулина. Выделенный в среду «белок обычно проще очищать, чем внутриклеточный. Помимо этого, использование штаммов Bacillus имеет то преимущество, что они не образуют эндотоксинов. Выяснилось, однако, что клетки Bacillus эффективно экскретируют, видимо, лишь неко­торые типы полипептидов. В опытах с дрожжами проблема сек­реции была решена путем создания векторов, содержащих сиг­нальные последовательности генов а-фактора гормона спарива­ния или токсина-«убийцы».