Криобиологические сосуды > Материалы и биотехнология > Подходы к усовершенствованию производства микробных полисахаридов

Подходы к усовершенствованию производства микробных полисахаридов


Использование микроорганизмов для получения промышленно ценных полисахаридов можно сделать более эффективным с помощью следующих усовершенствований:
1) увеличения ско­рости образования полисахаридов и повышения их выхода;
2) модификации получаемых полисахаридов;
3) изменения по­верхностных свойств микроорганизмов-продуцентов для об­легчения отделения клеток на последующих этапах переработ­ки;
4) устранения ферментативных активностей, способных вы­звать нежелательные модификации полисахаридов;
5) переноса генетических детерминант синтеза полисахаридов в технологи­чески более удобные организмы-продуценты.
Скорость или степень превращения углеводного субстрата в полимерный продукт можно увеличить путем повышения удельной активности участвующих в синтезе ферментов, изме­нения механизмов регуляции синтетического процесса или уве­личения доступности предшественников полисахарида. Число ферментативных стадий биосинтетического процесса зависит от сложности данного полимера, и любая попытка увеличить вы­ход полимера должна быть основана на ясном представлении о данном биосинтетическом пути и механизмах его метаболиче­ского контроля. В настоящее время выход увеличивают путем отбора случайных мутантов. Скорость потребления субстрата можно повысить путем дупликации генов, продукты которых участвуют в формировании механизмов поглощения, но такой способ не обязателен, если у данного организма имеется не­сколько путей транспорта для каждого субстрата.
Для модификации полисахарида в целях улучшения того или иного его свойства также необходимо располагать некото­рыми сведениями об особенностях данного пути синтеза. Ксан-тан в водных растворах образует микрогели за счет взаимо­действия пируваткеталей полимера с катионами. Эти группы можно удалить путем обработки полимера щавелевой или трифторуксусной кислотой. Существуют также мутанты, обра­зующие ксантаны, лишенные остатков пирувата или ацетиль­ных групп, а в остальном имеющие неизмененную углеводную структуру и более низкую вязкость. Однако отбор таких му­тантов затруднен тем, что модифицированные продукты часто неотлюшмы от исходных полисахаридов, хотя колонии и могут различаться по внешнему виду и иметь тенденцию к прикреп­лению к поверхности культуральной среды. Другие способы решения данной проблемы предусматривают выращивание бактерий дикого типа в присутствии ингибиторов ацилирования или при недостатке калия либо магния. Можно также выде­лить мутанты, образующие полисахариды с большей молеку­лярной массой и, следовательно, с большей вязкостью, но в ос­тальном не отличающиеся от обычных по химическому составу. Длина полимерных цепей иногда зависит от условий роста. Например, в непрерывных культурах Xanthomonas juglandis при малом разведении образуются более длинные неразветв­ленные молекулы.
Процесс выделения полисахаридов можно облегчить путем изменения поверхностных свойств микроорганизма-продуцента (например, за счет удаления поверхностного полимерного ма­териала типа липополисахаридов). В подобных мутантных культурах происходит аутоагглютинация и спонтанная флокуляция, что уменьшает число необходимых операций центрифу­гирования. Однако нужно внимательно следить за тем, чтобы у таких мутантов клеточный материал, например белки, не «утекал» из периплазматического пространства или не проис­ходил лизис с загрязнением конечного продукта. К другим из­менениям относятся мутации капсулообразующих организмов, приводящие к появлению стабильных, образующих слизи бак­терий, а также получение устойчивых к фагам мутантов, что уменьшает риск заражения фагом в процессе производства.
Некоторые микроорганизмы образуют экзополисахариды, впоследствии разрушаемые гидролитическими ферментами. На­пример, Azotobacier vinelandii синтезирует альгинат и альгиназу (альгинат — лиазу). Продуценты ксантана часто выделяют активную целлюлазу, которая способна вызвать деградацию при последующем добавлении ксантана к продуктам, содержа­щим целлюлозу. Устранить такую нежелательную фермента­тивную активность можно либо путем умелого подбора условий культивирования, либо за счет использования мутантов, неспо­собных к образованию подобных гидролитических ферментов.
Штаммы, продуцирующие полисахариды, синтезируют так­же другие полимерные продукты, например другие полисахари­ды, поли-р-гидроксибутират или гликоген. При этом из нужного биосинтетического процесса может изыматься значительное ко­личество углерода. Следует заняться поисками мутантов, ли­шенных подобного рода альтернативных синтетических путей. Образование гликогена у прокариот отличается от других пу­тей синтеза полисахаридов, и получение мутантов, дефектных по ключевым ферментам этого пути (ADP-глюкозопирофосфо-рилазе и гликоген-синтетазе), является эффективным решением данной проблемы. Однако для реализации этого подхода необ­ходимо иметь представление о регуляторных механизмах обоих путей. Некоторые виды продуцентов курдлана синтезируют также значительные количества сукциноглюкана. Были полу­чены мутанты Alcaligenes spp., Agrobacteriutn radiobacter и Rhizobium trifolii, не обладающие этой активностью. Выделены четыре типа мутантов: продуценты сукциноглюкана, продуцен­ты курдлана, продуценты обоих полимеров и мутанты, не син­тезирующие курдлан и образующие небольшие количества сук­циноглюкана. Сукциноглюкан является гетерополисахаридом глюкозы и галактозы. Оба полимера содержат ацетильные группы и остатки пировиноградной кислоты. Механизм этих изменений в синтезе полимеров неизвестен.
В некоторых случаях предпочтительным является перенос генетических детерминант синтеза полисахаридов. Например, перенос детерминант синтеза альгината из штамма Pseudomo-nas aeruginosa, выделенного исходно от больного цистофиброзом, в непатогенные виды Pseudomonas создает предпосылки для промышленного использования этого процесса. Положение генов, ответственных за синтез альгината, уже установлено. Представляет интерес и перенос генов, детерминирующих син­тез ксантана, в хозяина, непатогенного для растений. Детерми­нанты синтеза полисахаридов можно ввести и в более быстро­растущие бактериальные штаммы. Выявлена также возмож­ность превращения штаммов, не способных к синтезу экзополисахаридов, в штаммы — продуценты этих полимеров при помощи отбора на резистентность к карбенициллину. Эта методика с успехом применялась в опытах с некоторыми вида­ми Pseudomonas с целью получения тис-мутантов, синтезиру­ющих полисахариды. По всей вероятности, в подобных случаях у организмов дикого типа синтез альгината был супрессирован, а мутация по соответствующим генам создала условия для экспрессии.